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一種抑制幽門螺桿菌的益生菌

發表時間:2021-06-22 13:19作者:一種抑制幽門螺桿菌的益生菌


一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物,其特征在于,所述益生菌組合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳桿菌10~30份、植物乳桿菌10~30份、羅伊氏乳桿菌10~30份和唾液乳桿菌10~30份。2 .根據權利要求1所述益生菌組合物,其特征在于,所述益生菌組合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳桿菌15~25份、植物乳桿菌15~25份、羅伊氏乳桿菌15~25份和唾液乳桿菌15~25份。3 .根據權利要求1或2所述益生菌組合物,其特征在于,所述鼠李糖乳桿菌包括鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)LN56,保藏編號為CGMCC No .17370;所述植物乳桿菌包括植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LN66,保藏編號為CGMCC No .17369;所述羅伊氏乳桿菌包括羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏編號為CGMCC No .17541;所述唾液乳桿菌包括唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏編號為CGMCCNo .17542。4 .根據權利要求3所述益生菌組合物,其特征在于,所述鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉、植物乳桿菌LN66的菌粉、羅伊氏乳桿菌LN83的菌粉和唾液乳桿菌LN12的菌粉中活菌數量均為1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g。5 .權利要求1~4任一項所述益生菌組合物在制備抑制幽門螺桿菌生長的食品或藥物或補充劑中的應用。6 .權利要求1~4任一項所述益生菌組合物在制備抑制幽門螺桿菌毒力因子基因表達的食品或藥物或補充劑中的應用。7 .根據權利要求6所述應用,其特征在于,所述毒力因子包括CagA、VacA和Ure。8 .權利要求1~4任一項所述益生菌組合物在制備預防和/或治療幽門螺桿菌感染的藥物中的應用。9 .一種預防和/或治療幽門螺桿菌感染的藥物,其特征在于,所述藥物以權利要求1~4任一項所述益生菌組合物為有效成分。權 利 要 求 書 1/1 頁2CN 112458020 A2一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物及應用技術領域[0001] 本發明屬于食品和藥品技術領域,具體涉及一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物及應用。背景技術[0002] 幽門螺桿菌(Helicobecter pylori,簡稱Hp)可引發諸多消化道疾病,其可長期寄生于胃黏膜,容易引發慢性胃炎、胃潰瘍甚至胃癌,被世界衛生組織(WHO)歸為I類致癌因子。[0003] 針對清除Hp的標準克拉霉素三聯療法在1996年就被提出并廣泛應用,目前推薦的含鉍劑的抗生素四聯療法作為臨床根除Hp的首選方案,但隨著Hp對抗生素耐藥性的不斷提升,以及抗生素和鉍劑所帶來的相關副作用如腹脹、腹瀉和便秘等發生率的提高,大大降低了抗生素療法的根治效果及患者的耐受性和服藥依從性。[0004] 益生菌療法是一種新興的治療Hp的療法,近年來的研究和臨床實踐表明乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌制劑的應用在提高Hp的根除率和減少治療副作用等方面均具有一定的療效。益生菌治療Hp的功能屬菌株依賴型,且不同益生菌菌株組合后對于治療Hp的效果,菌株間既可能存在協同也可能存在拮抗作用。所以對于治療Hp的益生菌菌株的選擇及不同菌株組合物治療Hp的協同作用效果仍有待進一步的大量研究來證實。發明內容[0005] 有鑒于此,本發明的目的在于提供一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物及應用,所述益生菌組合物可發揮顯著的抑制和殺傷幽門螺桿菌的協同作用。[0006] 為了實現上述發明目的,本發明提供以下技術方案:[0007] 本發明提供了一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物,所述益生菌組合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳桿菌10~30份、植物乳桿菌10~30份、羅伊氏乳桿菌10~30份和唾液乳桿菌10~30份。[0008] 優選的,所述益生菌組合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳桿菌15~25份、植物乳桿菌15~25份、羅伊氏乳桿菌15~25份和唾液乳桿菌15~25份。[0009] 優選的,所述鼠李糖乳桿菌包括鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)LN56,保藏編號為 C G M C C N o .1 7 3 7 0;所述植物乳桿菌包括植物乳桿菌 (L a c t o ba c i l l u splantarum)LN66,保藏編號為CGMCC No .17369;所述羅伊氏乳桿菌包括羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏編號為CGMCC No .17541;所述唾液乳桿菌包括唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏編號為CGMCC No .17542。[0010] 優選的,所述鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉、植物乳桿菌LN66的菌粉、羅伊氏乳桿菌LN83的菌粉和唾液乳桿菌LN12的菌粉中活菌數量均為1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g。[0011] 本發明還提供了上述益生菌組合物在制備抑制幽門螺桿菌生長的食品或藥物或補充劑中的應用。說 明 書 1/11 頁3CN 112458020 A3[0012] 本發明還提供了上述益生菌組合物在制備抑制幽門螺桿菌毒力因子基因表達的食品或藥物或補充劑中的應用。[0013] 優選的,所述毒力因子包括CagA、VacA和Ure。[0014] 本發明還提供了上述益生菌組合物在制備預防和/或治療幽門螺桿菌感染的藥物中的應用。[0015] 本發明還提供了一種預防和/或治療幽門螺桿菌感染的藥物,所述藥物以上述益生菌組合物為有效成分。[0016] 本發明提供了一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物,所述益生菌組合物對于幽門螺桿菌的抑制和殺傷作用顯著高于單一菌株;且所述益生菌組合物較單一菌株更能有效降低幽門螺桿菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達水平,因此所述益生菌組合物中的4種菌產生了顯著的協同效應。[0017] 本發明實施例證明,經口服一定數量所述益生菌組合物后,可在體內有效抑制幽門螺桿菌生長,降低幽門螺桿菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達水平,從而減少對胃黏膜細胞的空包化損傷等,抑制脲酶Ure的基因表達使幽門螺桿菌產氨能力下降,使其周圍環境的pH下降不利于其自身的生長而易被抗生素殺滅。對于幽門螺桿菌感染模型小鼠,使其進食所述益生菌組合物,清除幽門螺桿菌的效果顯著優于各菌株單獨應用的效果,所述益生菌組合物的應用能夠根除小鼠胃黏膜上的幽門螺桿菌并使炎癥消失。人體服用所述益生菌組合物的結果也表明,該組合物可顯著降低人體中幽門螺桿菌數量,有效率達90%,幽門螺桿菌轉陰率達70%。[0018] 生物保藏信息[0019] 鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)LN56,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏機構簡稱:CGMCC,保藏日期為2019年03月20日,生物保藏編號為CGMCC No .17370;[0020] 植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LN66,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏機構簡稱:CGMCC,保藏日期為2019年03月20日,生物保藏編號為CGMCC No .17369;[0021] 羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏機構簡稱:CGMCC,保藏日期為2019年04月10日,生物保藏編號為CGMCC No .17541;[0022] 唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏機構簡稱:CGMCC,保藏日期為2019年04月10日,生物保藏編號為CGMCC No .17542。具體實施方式[0023] 本發明提供了一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物,所述益生菌組合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳桿菌10~30份、植物乳桿菌10~30份、羅伊氏乳桿菌10~30份和唾液乳桿菌10~30份。[0024] 本發明所述益生菌組合物中,所述鼠李糖乳桿菌的重量份優選為15~25份,更優選為20份。本發明所述鼠李糖乳桿菌優選包括鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)說 明 書 2/11 頁4CN 112458020 A4LN56,保藏編號為CGMCC No .17370。本發明所述鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉中活菌數量優選為1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,更優選為5 .0×1010~2 .0×1011CFU/g,最優選為8 .0×1010CFU/g。本發明對所述鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉的制備方法并沒有特殊限定,優選包括:1)將所述鼠李糖乳桿菌LN56接種在MRS培養液或改良MRS培養液中,在36~38℃下發酵12~24h,得到鼠李糖乳桿菌LN56發酵液;所述改良MRS培養液以MRS培養液為基礎培養基,包含質量濃度為0 .05%的半胱氨酸鹽酸鹽;[0025] 2)將所述鼠李糖乳桿菌LN56發酵液離心,收集沉淀物,得到鼠李糖乳桿菌LN56菌泥;[0026] 3)將所述鼠李糖乳桿菌LN56菌泥進行真空冷凍干燥,得到鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉。[0027] 本發明步驟1)所述接種的接種量優選為1,所述發酵的溫度優選為37℃,所述發酵的時間優選為20h。本發明所述發酵優選為厭氧發酵。本發明步驟2)所述離心的轉速優選為8000~12000r/min,更優選為10000r/min;所述離心的時間優選為60~120min,更優選為90min。本發明步驟3)中所述真空冷凍干燥,優選包括:將菌泥、水、凍干載體混合后進行真空冷凍干燥;所述菌泥、水、凍干載體的質量比優選為1:(1~6):(1~5),更優選為1:3:2。本發明所述凍干載體優選包括脫脂奶粉或麥芽糊精。本發明對所述真空冷凍干燥的儀器并沒有特殊限定,優選采用東富龍LYO-20真空冷凍干燥機,在進行真空冷凍干燥時,優選設置傳熱隔板溫度為-10~10℃,更優選為-5℃;干燥箱中真空度優選設置為10~16Pa,更優選為13Pa。本發明所述真空冷凍干燥的時間優選為20~48h,更優選為28h。本發明所述鼠李糖乳桿菌LN56能夠抑制幽門螺桿菌的生長,降低幽門螺桿菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達量。[0028] 本發明所述益生菌組合物中包括植物乳桿菌的菌粉,所述植物乳桿菌的菌粉重量份優選為15~25份,更優選為20份。本發明所述植物乳桿菌的菌粉的制備方法優選與上述相同,在此不再贅述。本發明所述植物乳桿菌優選包括植物乳桿菌 (La cto ba cillusplantarum)LN66,保藏編號為CGMCC No .17369。本發明所述植物乳桿菌LN66的菌粉中活菌數量優選為1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,更優選為5 .0×1010~2 .0×1011CFU/g,最優選為8 .0×1010CFU/g。本發明中,所述植物乳桿菌LN66能夠抑制幽門螺桿菌的生長,降低幽門螺桿菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達量。[0029] 本發明所述益生菌組合物中優選包括羅伊氏乳桿菌15~25重量份,優選為20重量份。本發明所述羅伊氏乳桿菌的菌粉的制備方法優選與上述相同,在此不再贅述。本發明所述羅伊氏乳桿菌優選包括羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏編號為CGMCCNo .17541。本發明所述羅伊氏乳桿菌LN83的菌粉中活菌數量為1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,優選為1 .0×1010~1 .5×1011CFU/g,更優選為2 .0×1010~1 .0×1011CFU/g,最優選為5 .0×1010CFU/g。本發明中所述羅伊氏乳桿菌LN83能夠抑制幽門螺桿菌的生長,降低幽門螺桿菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達量。[0030] 本發明所述益生菌組合物中優選包括15~25重量份的唾液乳桿菌,更優選為20份。本發明所述唾液乳桿菌的菌粉的制備方法優選與上述相同,在此不再贅述。本發明所述唾液乳桿菌優選包括唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏編號為CGMCCNo .17542。本發明所述唾液乳桿菌LN12的菌粉中活菌數量為1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,說 明 書 3/11 頁5CN 112458020 A5優選為1 .0×1010~1 .5×1011CFU/g,更優選為2 .0×1010~1 .0×1011CFU/g,最優選為5 .0×1010CFU/g。本發明中所述唾液乳桿菌LN12能夠抑制幽門螺桿菌的生長,降低幽門螺桿菌毒力因子CagA和VacA的基因表達量。[0031] 本發明優選將上述鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和唾液乳桿菌按照1:1:1:1的質量比混合后,可產生協同增效作用:如4株單一菌株LN56、LN66、LN83和LN12的抑菌圈直徑分別為18 .33mm、18 .43mm、17 .33mm和17 .02mm,而益生菌組合物的抑菌圈直徑為24 .48mm,具有極顯著差異;4株單一菌株LN56、LN66和LN83對毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達量略有下調作用,LN12不具有下調作用,但是益生菌組合物可使CagA、VacA和Ure的基因表達量分別下調20倍、10倍和8倍;單獨應用上述四株菌,只能使幽門螺桿菌數量降低和炎癥程度降低而不能使其根除和消失,但是所述益生菌組合物能夠根除小鼠胃黏膜上的幽門螺桿菌并使炎癥消失,因此可將所述益生菌組合物用于預防和/或治療幽門螺桿菌感染。[0032] 本發明還提供了上述益生菌組合物在制備抑制幽門螺桿菌生長的食品或藥物或補充劑中的應用。本發明對所述食品或藥物或補充劑的劑型并沒有特殊限定,優選為粉劑、片劑、顆粒劑、水劑、丸劑、膠囊劑或凝膠劑,更優選為粉劑。在本發明中,當所述食品或藥物或補充劑的劑型為粉劑時,優選還包括輔料,所述輔料優選為麥芽糊精、赤蘚糖醇和低聚果糖。本發明對所述食品或藥物或補充劑的制備方法并沒有特殊限制,采用本領域常規制備方法即可。本發明所述食品或藥物或補充劑中益生菌組合物的質量百分含量優選為20%~100%,更優選為90%。[0033] 本發明還提供了上述益生菌組合物在制備抑制幽門螺桿菌毒力因子基因表達的食品或藥物或補充劑中的應用。本發明所述毒力因子優選包括CagA、VacA和Ure,且相比于空白對照,食用所述益生菌組合物后,CagA、VacA和Ure的基因表達量分別下調20倍、10倍和8倍。本發明所述食品或藥物或補充劑的劑型及制備方法優選與上述內容相同,在此不再贅述。[0034] 本發明還提供了上述益生菌組合物在制備預防和/或治療幽門螺桿菌感染的藥物中的應用。本發明口服一定數量的所述藥物后,可在體內有效抑制幽門螺桿菌生長,降低幽門螺桿菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達水平,從而減少對胃黏膜細胞的空包化損傷等,抑制脲酶Ure的基因表達使幽門螺桿菌產氨能力下降,使其周圍環境的pH值下降不利于其自身的生長而易被抗生素殺滅;利用所述藥物處理幽門螺桿菌感染模型小鼠,其清除幽門螺桿菌的效果顯著優于LN56、LN66、LN83和LN12菌株單獨應用的效果,4株益生菌組合物的應用能夠根除小鼠胃黏膜上的幽門螺桿菌并使炎癥消失,而單獨應用上述四株菌,只能使幽門螺桿菌數量降低和炎癥程度降低而不能使其根除和消失。人體服用所述益生菌組合物的結果也表明,所述藥物可顯著降低人體中幽門螺桿菌數量,有效率達90%,幽門螺桿菌轉陰率達70%。[0035] 本發明還提供了一種預防和/或治療幽門螺桿菌感染的藥物,所述藥物以上述益生菌組合物為有效成分。[0036] 本發明對所述藥物的劑型并沒有特殊限定,優選為粉劑、片劑、顆粒劑、水劑、丸劑、膠囊劑或凝膠劑,更優選為粉劑。在本發明中,當所述藥物的劑型為粉劑時,優選還包括輔料,所述輔料優選為麥芽糊精、赤蘚糖醇和低聚果糖。本發明對所述藥物的制備方法并沒說 明 書 4/11 頁6CN 112458020 A6有特殊限制,采用本領域常規制備方法即可。本發明所述藥物中益生菌組合物的質量百分含量優選為20%~100%,更優選為90%。本發明在利用所述藥物預防和/或治療幽門螺桿菌感染時,以所述益生菌組合物的用量計,優選服用量為1~20g/天,更優選為8g/天。[0037] 下面結合實施例對本發明提供的一種抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物及應用進行詳細的說明,但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。[0038] 實施例1[0039] 采用鼠李糖乳桿菌LN56、植物乳桿菌LN66、羅伊氏乳桿菌LN83和唾液乳桿菌LN12;分別在MSR培養基中37℃下兼性厭氧活化培養24h后以10000rpm轉速離心10min去除菌體得到無細胞發酵上清液,分別檢測單種菌的無細胞發酵上清液(CFS)及這4種菌的CFS的組合物對幽門螺桿菌的抑制效果。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori ATCC 43504)購于美國菌種保藏中心。幽門螺桿菌固體培養采用含10%無菌脫纖維羊血哥倫比亞血瓊脂培養基在37℃微需氧條件下培養3~4d,液體培養采用含10%胎牛血清布氏肉湯培養基在37℃微需氧條件下,80rpm培養2~3d。[0040] 具體檢測方法為:牛津杯擴散實驗法,將對數中期的幽門螺桿菌菌液用肉湯培養液將細菌密度調節至2×106CFU/mL,取200μL菌液至含10%無菌脫纖維羊血哥倫比亞血瓊脂培養基平板并用無菌玻耙涂布均勻,用鑷子將牛津杯小心放置在該固體平板上,分別取上述制備的鼠李糖乳桿菌LN56的CFS、植物乳桿菌LN66的CFS液、羅伊氏乳桿菌LN83的CFS、唾液乳桿菌LN12的CFS和上述4種菌的CFS等比例組合物各200μL注入牛津杯孔徑內,以MRS液體培養基作為陰性對照。先將固體平板在4℃冰箱擴散3~4h,然后將平板轉移至37℃培養箱微好氧培養,48h后觀察抑菌結果并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑,重復3次。[0041] 單一益生菌的CFS和4種CFS的等比例組合物對幽門螺桿菌的抑菌效果如表1所示,單一益生菌CFS對幽門螺桿菌均具有不同程度的抑制作用,而4種益生菌的CFS等比例組合物對幽門螺桿菌的抑制效果明顯大于單一益生菌CFS的抑制效果,具有顯著的協同效應。[0042] 表1益生菌CFS對幽門螺桿菌的抑制作用[0043][0044] 注:*表示與MRS比存在顯著性差異(P<0 .05),**表示4種菌等比例組合物與單種菌比存在顯著性差異(P<0 .05)[0045] 實施例2[0046] 采用實施例1所獲得的鼠李糖乳桿菌LN56、植物乳桿菌LN66、羅伊氏乳桿菌LN83、說 明 書 5/11 頁7CN 112458020 A7唾液乳桿菌LN12的無細胞發酵上清液(CFS)及這4種菌的CFS的組合物,檢測對幽門螺桿菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達水平的影響。[0047] 具體檢測方法為:將幽門螺桿菌(Helicobacter pylori ATCC 43504)在10%胎牛血清布氏肉湯培養基中微好氧培養48~72h,用肉湯稀釋菌液至細菌密度為1×107CFU/mL。在不同三角瓶中分別加入5mL LN56 CFS、5mL LN66 CFS、5mL LN83 CFS、5mL LN12 CFS、及5mL以上4種菌CFS的等比例組合物(各1 .25mL),然后在每個三角瓶中再分別加入5mL 10%胎牛血清布氏肉湯培養基和10mL 1×107CFU/mL的Hp菌液,37℃微好氧培養48~72h,80rpm。對照組用5mL MRS替換CFS。[0048] 完成培養后,對每個三角瓶中的內容物離心棄去上清液,用無菌PBS緩沖液小心地清洗菌體、離心,隨后加入10mL無菌PBS緩沖液,反復吹打,轉移至無RNA酶污染的離心管中。總RNA的提取采用TransZol Up Plus RNA Kit進行。在得到總RNA后,通過PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser反轉錄合成cDNA。最后加入TB Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)染料在qTOWER3G熒光定量PCR儀上進行熒光定量檢測。實驗中所用引物列于表2。熒光定量PCR儀參數設置為:95℃預變性2min;循環40次:95℃,15s;55℃,15s;68℃,20s。最后,以Hp 16S rRNA為內參基因,通過2-ΔΔCt法處理實驗數據,確定基因相對表達量,結果見表3,4種CFS等比例組合物對Hp分泌的主要毒力因子基因表達水平的抑制作用顯著強于單個菌的CFS的抑制作用,說明所述4個菌的CFS組合物對所述毒力因子的基因表達的抑制具有協同效應,差別具有統計學意義(P<0 .05)。與對照組相比,所述4個菌的CFS組合物使CagA、VacA和Ure的基因表達量分別下調了約20倍、10倍和8倍,而單個菌的CFS對CagA的基因表達量的下調幅度為2 .31倍~4 .76倍,對VacA的基因表達量的下調幅度為2 .20倍~2 .82倍,對Ure的基因表達量的下調幅度為1倍~3 .31倍,其中LN12 CFS對Ure的基因表達量沒有下調作用??梢钥闯?,LN56、LN66、LN83和LN12單個菌的CFS對Hp的3個毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達量雖有下調作用,但總體上均顯著小于所述4個菌的CFS組合物對他們的下調作用。4個菌的CFS等比例組合物比單個菌的CFS能更顯著地抑制Hp毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表達水平,說明所述4個菌的CFS組合物能更好地削弱Hp的毒性。[0049] 表2實時熒光定量PCR引物[0050][0051][0052] 表3益生菌CFS對Hp毒力因子基因表達水平的抑制作用說 明 書 6/11 頁8CN 112458020 A8[0053][0054] 注:表中數值為mRNA相對表達量,*表示4種CFS組合物與單CFS存在顯著性差異(P<0 .05)[0055] 實施例3[0056] 將鼠李糖乳桿菌LN56、植物乳桿菌LN66、羅伊氏乳桿菌LN83和唾液乳桿菌LN12分別接種在MRS培養液中在37℃下發酵16~24h,分別得到鼠李糖乳桿菌LN56發酵液、植物乳桿菌LN66發酵液、羅伊氏乳桿菌LN83發酵液和唾液乳桿菌LN12發酵液;[0057] 將鼠李糖乳桿菌LN56發酵液、植物乳桿菌LN66發酵液、羅伊氏乳桿菌LN83發酵液和唾液乳桿菌LN12發酵液分別以10000r/min離心90min,收集沉淀物,分別得到鼠李糖乳桿菌LN56菌泥、植物乳桿菌LN66菌泥、羅伊氏乳桿菌LN83菌泥和唾液乳桿菌LN12菌泥;[0058] 將得到的鼠李糖乳桿菌LN56菌泥、植物乳桿菌LN66菌泥、羅伊氏乳桿菌LN83菌泥或唾液乳桿菌LN12菌泥分別與菌泥3倍重量份的水和菌泥2倍重量份的凍干載體混合,在-5℃下進行真空冷凍干燥28h,分別得到鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉、植物乳桿菌LN66的菌粉、羅伊氏乳桿菌LN83的菌粉或唾液乳桿菌LN12的菌粉。[0059] 實施例4[0060] 取10g實施例3制備得到的鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉(活菌數為1 .0×1011CFU/g)、30g實施例3制備得到的植物乳桿菌LN66的菌粉(活菌數為1 .0×1011CFU/g)、10g實施例3制備得到的羅伊氏乳桿菌LN83的菌粉(活菌數為3 .0×1010CFU/g)、30g實施例3制備得到的唾液乳桿菌LN12的菌粉(活菌數為3 .0×1010CFU/g)和60g麥芽糊精以1000r/min的轉速攪拌10min,得到抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物。[0061] 實施例5[0062] 取30g實施例3制備得到的鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉(活菌數為3 .0×1010CFU/g)、10g實施例3制備得到的植物乳桿菌LN66的菌粉(活菌數為3 .0×1010CFU/g)、30g實施例3制備得到的羅伊氏乳桿菌LN83的菌粉(活菌數為1 .0×1011CFU/g)、10g實施例32制備得到的唾液乳桿菌LN12的菌粉(活菌數為1 .0×1011CFU/g)和60g麥芽糊精以1000r/min的轉速攪拌10min,得到抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物。[0063] 實施例6[0064] 取20g實施例3制備得到的鼠李糖乳桿菌LN56的菌粉(活菌數為8 .0×1010CFU/g)、20g實施例3制備得到的植物乳桿菌LN66的菌粉(活菌數為8 .0×1010CFU/g)、20g實施例3制備得到的羅伊氏乳桿菌LN83的菌粉(活菌數為5 .0×1010CFU/g)、20g實施例3制備得到的唾說 明 書 7/11 頁9CN 112458020 A9液乳桿菌LN12的菌粉(活菌數為5 .0×1010CFU/g)和60g麥芽糊精以1000r/min的轉速攪拌10min,得到抑制幽門螺桿菌的益生菌組合物。[0065] 實施例7[0066] 選取8~10周齡健康雄性SPF級BABL/C小鼠188只,除陰性對照組20只外,其余小鼠予幽門螺桿菌(Hp)(含量109cfu/ml)新鮮懸菌液1ml灌胃,隔天1次,共8次。末次灌胃1周后,取8只小鼠殺死后取胃黏膜進行快速尿素酶試驗,結果均為陽性,胃黏膜組織HE染色鏡檢顯示胃黏膜上皮細胞脫落并有炎性細胞浸潤,胃黏膜組織特殊銀染色鏡檢顯示Hp,兩者皆證實Hp感染模型已建立。[0067] 已確立Hp感染的小鼠,按隨機表格法隨機分為以下8組(每組20只),再加上陰性對照組20只,陰性對照組和Hp感染陽性對照組灌胃PBS緩沖液,其余7組分別灌胃實施例4、5和6制備得到的益生菌組合物(4 .0×109CFU/天),以及實施例3制備的鼠李糖乳桿菌LN56(4 .0×109CFU/天)、植物乳桿菌LN66(4 .0×109CFU/天)、羅伊氏乳桿菌LN83(4 .0×109CFU/天)和唾液乳桿菌LN12(4 .0×109CFU/天)。每天1次,連續灌胃處理14d,最后一次灌胃后1周將小鼠全部處死,取胃黏膜行組織病理學特殊銀染色評估Hp分布情況,HE染色鏡檢觀察胃黏膜炎癥程度評分。具體結果如表4所示,4株益生菌的組合物可顯著抑制幽門螺桿菌感染模型小鼠的幽門螺桿菌,特別是實施例6能夠使95%的小鼠胃黏膜的幽門螺桿菌轉陰、炎癥消失;而單獨應用上述4株菌,只能使幽門螺桿菌數量降低和炎癥程度降低而不能使其轉陰和消失。因此4株益生菌組合物的聯合應用,其抑制幽門螺桿菌效果顯著優于LN56、LN66、LN83和LN12菌株的單獨應用,且這4株益生菌的組合物具有協同效應,相比單獨任一菌株能更有效地抑制幽門螺桿菌。[0068] 表4益生菌對幽門螺桿菌感染模型小鼠的作用效果說 明 書 8/11 頁10CN 112458020 A10[0069][0070][0071] 注:表中數據為小鼠數量,-,+,++,+++分別代表幽門螺桿菌/炎癥程度的陰性/無炎癥、輕度陽性/輕度炎癥、中度陽性/中度炎癥和重度陽性/重度炎癥。灌胃后生長過程中的小鼠有死亡,所以在不同的分組中小鼠數量有少于20只的情況。分組后陽性對照組和陰性對照組在首次灌胃前分別處死10只小鼠,測定Hp分布和炎癥程度評分。[0072] 實施例8[0073] 分別應用本發明制備得到的益生菌組合物(4株菌活菌含量分別為2 .0×1010CFU/天,總活菌含量8 .0×1010CFU/天)和低劑量的該4株菌組合物(4株菌活菌含量分別為2 .0×109CFU/天,總活菌含量8 .0×109CFU/天)讓20名幽門螺桿菌陽性患者服用。采用13C-尿素呼氣試驗檢測幽門螺桿菌的變化:患者先憋氣15s,吐出一半的氣體,再將另外部分的氣體吹說 明 書 9/11 頁11CN 112458020 A11入集氣袋,稱為零氣;礦泉水送服13G膠囊1粒,靜坐30min后采集呼出的氣體,此為樣氣,將0min和30min的樣氣用紅外光譜儀進行檢測,記錄檢測結果,具體結果如表5所示,幽門螺桿菌感染患者服用本發明益生菌組合物14天后,其感染程度開始有下降趨勢,服用28天后,90%患者有明顯療效,其中70%患者幽門螺桿菌轉陰。同時以低于本發明規定劑量的益生菌組合物為對照,結果發現,患者服用28天后,抑制幽門螺桿菌的效果顯著低于本發明所述益生菌組合物,沒有患者能夠幽門螺桿菌轉陰。結果表明,本發明所述益生菌組合物中活菌含量為每種菌不低于2 .0×1010CFU/天,總活菌數不低于8 .0×1010CFU/天。[0074] DOB值判定:30min樣氣中所測13C-CO2的δ減去零時δ呼氣樣品的δ值之差:DOB=δ(30min)-δ(0min),DOB-4 .0%~4 .0%為陰性(-),DOB 4%~10%為輕度陽性(+),DOB 10%~20%為中等陽性(++),DOB>20%為強陽性(+++)。[0075] 表5不同活菌含量治療幽門螺桿菌感染的治療效果[0076][0077] 以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應說 明 書 10/11 頁12CN 112458020 A12視為本發明的保護范圍。
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